2023/11/29
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腸球菌通用染料法熒光定量 PCR 試劑盒
產(chǎn)品及特點：
腸球菌（Enterococcus spp.），為革蘭陽性（G+）球菌，廣泛分布于自然環(huán)境及人和動物消化道內(nèi)。20 世紀 80 年代以來，腸球菌嚴重感染的發(fā)生率和病死率明顯升高，并且由于腸球菌的固有耐藥和獲得性耐藥使許多常用抗菌藥物在治療腸球菌感染時失敗。因此快速靈敏檢測腸球菌具有重要意義。本產(chǎn)品就是以探針法熒光定量 PCR 技術(shù)為基礎(chǔ)開發(fā)的專門檢測腸球菌的通用試劑盒，它具有下列特點：
1. 即開即用，用戶只需要提供病毒樣品。
2. 根據(jù)腸球菌通用保守序列設(shè)計的專一性引物，與相關(guān)病毒無交叉反應。
3. 靈敏度可以達到幾百拷貝/反應。
4. 一管式熒光定量 PCR 檢測，避免后續(xù)污染。
5. 本試劑盒足夠 50 次 20μL 反應體系的熒光定量 PCR。
編號 | 規(guī)格 | |
試劑一 | 2×qPCR MagicMix | 500 μL（棕色管） |
試劑二 | 熒光 PCR 專用模板稀釋液 | 1 mL（黃蓋） |
試劑三 | 腸球菌通用染料法 PCR 引物混合液 | 100μL（白蓋） |
試劑四 | 腸球菌通用染料法 PCR 陽性對 照(1×10E8 拷貝/μL) | 50 μL（紅蓋） |
試劑五 | DNA 病毒裂解液（試用裝） | 15 次（9 mL） |
使用手冊 | 1 份 |
運輸及保存： 低溫運輸、-20℃保存，有效期一年。
自備試劑： DNA 模板、10×ROX（根據(jù)機型決定，具體見使用方法）。
使用方法 一、稀釋 PCR 陽性對照（以 10E2-10E7 拷貝/μL 這 6 個 10 倍稀釋度為例）
1. 注意：由于標準品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨立的區(qū)域進行，千萬不能污染樣品或本試劑盒的其他成分）。為增加產(chǎn)品穩(wěn)定性和避免擴散傳染性病原，本產(chǎn)品不提供活體樣品做陽性對照，只提供可以直接使用的 DNA 片段作為陽性對照。
2. 標記 6 個離心管，分別為 7，6，5，4，3，2。
3. 用帶芯槍頭分別加入 45 μL 熒光 PCR 專用模板稀釋液（最好用帶芯槍頭，下同）。
4. 在 7 號管中加入 5 μL 1×10E8 拷貝/μL 的陽性對照，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E7 拷貝/μL 的陽性對照。放冰上待用。
5. 換槍頭，在 6 號管中加入 5 μL 1×10E7 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E6 拷貝/μL 的陽性對照。放冰上待用。
6. 換槍頭，在 5 號管中加入 5 μL 1×10E6 拷貝/μL 的陽性對照到 5 號管中，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E5 拷貝/μL 的陽性對照。放冰上待用。
7. 重復上面的操作直到得到 6 個稀釋度的陽性對照。放冰上待用。
二、樣品 DNA 的制備：
8. 如果有 N 個樣品，必須設(shè)置 N+2 個提取，多出的一個是 PC（樣品制備陽性對照），一個是 NC（樣品制備陰性對照）?？梢杂?10μL 上步制備的 PCR 陽性對照的第 4 號（濃度為 1×10E4 拷貝/μL，10μL 相當于 1 萬拷貝）或第 5號（濃度為 1×10E5 拷貝/μL，10μL 相當于 10 萬拷貝）再加上一定量的水使總體積跟每次制備要求的體積一樣，以此作為 PC。另外用水作為 NC。如果每次制備需要 200μL 樣品，則 PC 和 NC 的體積也必須是 200μL。
9. 用自選方法純化樣品的 DNA，本試劑盒跟市場上大多數(shù)病毒 DNA 提取試劑盒兼容。也可以選購本公司的一管式病毒 DNAout 或其升級版柱式病毒DNAout。本試劑盒免費贈送 15 次一管式病毒 DNAout。
三、設(shè)置 qPCR 反應（20 μL 體系，在樣品制備室進行）：
10. 如果只做 1 次重復，則標記 N+9 個 PCR 管，其中 N+2 個用于上步得到的N+2 個樣品，1 個用于 PCR 陰性對照，6 個用于 PCR 陽性對照。如果做 2-3次重復，則反應設(shè)置數(shù)量相應增加 2 或 3 倍。
11. 在標記管中按下表加入各成分（本表只列出一次重復。樣品管和陰性對照設(shè)置完畢后才設(shè)置陽性對照，并且陽性對照樣品要等所有管子蓋上蓋子儲存好后最后加）：
成分 | 樣品管 N+2 個 | PCR 陰性 對照管 | PCR 陽性對照管（2-7 管） |
2×qPCR MagicMix （棕色管） | 10μL | 10μL | 各10μL |
腸球菌通用 PCR 引物 混合液（白蓋） | 2 μL | 2 μL | 各 2 μL |
自備 10×ROX (見注) | 2 μL | 2 μL | 各 2 μL |
N+2 待測樣品 DNA 模板 | 6 μL | 不加 | 不加 |
第 7 步所得 PCR 陽性 對照稀釋液（2-7 號） | 不加 | 不加 | 各 6μL（2 號樣到2 號管，3 號樣到3 號管…） |
注:僅 ABI7500、7700 和 7900 儀器需要使用 ROX 作為對照，其他熒光 PCR儀器（如 iCycler IQ、MJ Option、MJ Chromo4、MX3000、MX4000、RotorGene3000、RotorGene 6000 和 LightCycler480）不需要使用ROX，則用水替代。
12. 蓋上蓋子后上機，按下面參數(shù)進行 PCR（具體 PCR 參數(shù)可以根據(jù)儀器不同而自行優(yōu)化）。
過程 | 溫度 | 溫度 |
預變性 | 92℃ | 5 分鐘 |
PCR 反應 （30 個循環(huán)） | 94℃ | 60 秒 |
50℃ | 60 秒 | |
72℃ | 60 秒 |
13. 數(shù)據(jù)采集具體操作按所用儀器推薦的流程進行。本產(chǎn)品中所含的熒光染料在不結(jié)合 DNA時，最大吸收光譜在 471 nm，結(jié)合 DNA 時的最大吸收光譜在 500 nm，最大發(fā)射光譜在 530 nm。信號采集可以設(shè)置在復性或延伸步驟。
四、數(shù)據(jù)處理：
14. 如果把本試劑盒用于定量檢測，則以陽性對照濃度的 log 值為橫軸，以Ct 值為縱軸，繪制標準曲線。再以待測樣品的 Ct 值從標準曲線上推算出樣品DNA 濃度的 log 值，再推算出其濃度。
15. 如果把本試劑盒用于定性檢測，只判斷陽性或陰性，則陰性對照 Ct 必須大于或等于 40。陽性對照必須有熒光對數(shù)增長，有典型擴增曲線，Ct 值應該小于或等于 30。對待測樣品，如果其 Ct 大于或等于 40 則為陰性，如果小于或等于 35 則為陽性。如果在 35-40 之間，則重復一次。重復實驗的 Ct 值如果大于或等于 40 則為陰性，如果小于 40，則為陽性。
僅用于科研，不能用于臨床診斷！所有產(chǎn)品僅供科研使用，不得用于其他用途。
